Ультратом – основы гистологии

Объекты и методы исследования в Гистологии

Ультратом - основы гистологии

Основными Объектами исследования являются гистологические препараты, а главным методом исследования – микроскопирование.

Гистологический препарат должен быть достаточно прозрачным (тонким) и контрастным. Он изготавливается как из живых, так и из мёртвых (фиксированных) структур. Препарат может представлять собой взвесь клеток, мазок, отпечаток, плёнку, тотальный препарат и тонкий срез.

Процесс изготовления гистологических препаратов для микроскопических исследований включает в себя следующие основные этапы: 1) взятие материала и его фиксация; 2) уплотнение материала; 3) приготовление срезов; 4)окрашивание, или контрастирование срезов; 5) заключение срезов.

Для окрашивания применяются специальные гистологические красители с различным значением рН: кислые, нейтральные и основные. Структуры, окрашивающиеся ими, соответственно, называются оксифильными, нейтрофильными (гетерофильными) и базофильными.

Какими же методами пользуется гистологическая наука? Они довольно многочисленны и разнообразны:

Микроскопирование

Световая микроскопия. Современные микроскопы обладают высокоразрешающей способностью. Разрешающая способность определяется наименьшим расстоянием (d) между двумя рядом расположенными точками, которые можно видеть раздельно. Это расстояние зависит от длины световой волны (λ) и выражается формулой: d = 1/2 λ.

Минимальная длина волны видимой части спектра 0,4 мкм. Следовательно, разрешающая способность светового микроскопа составляет 0,2 мкм, а общее увеличение достигает 2500 раз.

Ультрафиолетовая микроскопия. Длина волны ультрафиолетового света – 0,2 мкм, следовательно, разрешающая способность ультрафиолетового микроскопа 0,1 мкм, но так как ультрафиолетовое излучение является невидимым, то для наблюдения исследуемого объекта необходим люминесцентный экран.

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Коротковолновое (невидимое) излучение, поглощаясь рядом веществ, возбуждает их электроны, которые излучают свет с большей длиной волны, становясь видимой частью спектра. Таким образом, добиваются повышения разрешающей способности микроскопа.

Фазовоконтрастная микроскопия позволяет излучать неокрашенные объекты.

Поляризационная микроскопия применяется для изучения архитектоники гистологических структур, например, коллагенового волокна.

Электронная микроскопия даёт возможности изучать объекты, увеличенные в десятки тысяч раз.

Микрофотосъёмка и микрокиносъёмка. Эти методы позволяют изучать фиксированные объекты на фотографиях и живые микроскопические объекты в движении.

Методы качественных и количественных исследований

Гисто и цитохимия, в том числе количественная, позволяет проводить качественный анализ исследуемых объектов на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях.

Цитоспектрофотометрия Даёт возможность изучать количественное содержание тех или иных биологических веществ в клетках и тканях на основе поглощения света определённой длины волны связанным ими красителем.

Дифференциальное центрифугирование позволяет разделять содержимое клеток, отличающихся между собой своей массой.

Радиография Основана на включении радиоактивной метки (например, радиоактивного йода, Н³-тимидина и др.) в обменный процесс.

Морфометрия позволяет производить измерение площадей и объёмов клеток, их ядер и органелл с помощью окуляр – и объект-микрометров и специальных сеток.

Применение ЭВМ для автоматической обработки цифрового материала.

Метод культуры тканей представляет собой поддержание жизнеспособности и деления клеток и тканей вне организма. Для этого используют специальные контейнеры с питательной средой, в которых создаются все необходимые условия для жизнедеятельности клеток.

С помощью этого метода можно изучать дифференцировку и функциональное становление клеток, закономерности их злокачественного перерождения и развития опухолевого процесса, межклеточное взаимодействие, поражение клеток и тканей вирусами и микроорганизмами, влияние лекарственных препаратов на обменные процессы в клетках и тканях и т. д.

Прижизненное (витальное) окрашивание используется для изучения явлений фагоцитоза и активности макрофагов, фильтрационной способности почечных канальцев и др.

Метод трансплантации тканей. Этот метод применяют с целью изучения поведения клеток и их морфофункционального состояния при их пересадке в другой организм. К примеру, этот метод используется для поддержания жизни животных, подверженных облучению смертельной дозой.

Микроманипуляции. Данный метод получил применение в молекулярной биологии, генной инженерии, а также при клонировании, когда с помощью микроманипулятора удаляют ядро из яйцеклетки с гаплоидным набором хромосом и пересаживают в неё ядро соматической клетки с диплоидным набором хромосом.

Источник: https://veterinarua.ru/gistologiya/19-ob-ekty-i-metody-issledovaniya-v-gistologii.html

Тема 2: гистологическая техника

Ультратом - основы гистологии

Основныепринципы приготовления препаратов длясветовой и электронной микроскопии,взятие материала (биопсия, игловаяпункционная биопсия, аутопсия). Фиксация,обезвоживание, уплотнение объектов,приготовление срезов на микротомах иультрамикротомах. Виды мипрепаратов -срез, мазок, отпечаток, пленки, шлиф.Окрашивание и контрастированиепрепаратов. Понятие о гистологическихкрасителях.

Микроскопическая техника

Главныеэтапы цитологического и гистологическогоанализа:

– выбор объектаисследования

– подготовка егодля изучения в микроскопе

– применение методовмикроскопирования

– качественный иколичественный анализ полученныхизображений

Методы, применяемыев гистологической технике:

1. Прижизненные.

2. Посмертные.

I прижизненные методы

Целью прижизненныхисследований является получениеинформации о жизнедеятельности клетки:движение, деление, рост, дифференцировка,взаимодействие клеток, продолжительностьжизни, разрушение, реактивные измененияпод действием различных факторов.

Исследованиеживых клеток и тканей возможно внеорганизма (invitro)или внутри организма (invivo).

А.Исследование живых клеток и тканей вкультуре (invitro)

Метод культивирования

Различают:а)суспензионные культуры (клетки,взвешенные в питательной среде),б)тканевые, в)органные, г)монослойные.

Метод культивированияткани вне организма является самымраспространенным. Культивировать тканьможно в специальных прозрачныхгерметически закрытых камерах. Встерильных условиях в камеру помещаюткаплю питательной среды.

Наилучшейпитательной средой является плазмакрови, к которой добавляют эмбриональныйэкстракт (вытяжка из тканей зародыша,содержащая большое количество веществ,стимулирующих рост).

Туда же помещаюткусочек органа или ткани (не более 1мм3), которые необходимо культивировать.

Выдерживатькультивируемую ткань следует притемпературе тела организма, тканькоторого взята для исследования. Таккак питательная среда быстро приходитв негодность (в ней накапливаютсяпродукты распада, выделяемые культивируемойтканью), то каждые 3-5 дней ее нужно менять.

Использованиеметода культивирования позволиловыявить ряд закономерностей дифференцировки,злокачественного перерождения клеток,взаимодействий клеток между собой, атакже с вирусами и микробами. Культивированиеэмбриональных тканей позволило изучитьразвитие кости, хряща, кожи и др.

Особую значимостьметод культивирования имеет дляпроведения экспериментальных наблюденийна клетках и тканях человека, в частностидля определения пола, злокачественногоперерождения, наследственных заболеванийи др.

Недостаткиметода:

1.Главным недостатком этого методаявляется то, что ткань либо органисследуется в отрыве от организма. Неиспытывая нейрогуморального влиянияорганизма, она теряет присущую ейдифференцировку.

2. Необходимостьчастых пересадок (при длительномкультивировании).

3. Одинаковыйкоэффициент лучепреломления тканей.

Б. Прижизненное исследование клеток в организме (in vivo)

1.Наблюдение структур в живом организме.Пример:с помощьюспециальных просвечивающихмикроскопов-иллюминаторов можнонаблюдать циркуляцию крови в микрососудах.

2.Методвживления прозрачных камерв организм животного. Исследуемый объектпомещается в прозрачную камеру (снабженнуюмикроотверстиями для осуществленияобмена веществ) и вживляется, чаще всего,в ушную раковину экспериментальногоживотного. С помощью микроскопа можнонаблюдать динамику изменения клеток итканей в течение длительного времени.

3.Методиспользования естественных прозрачныхкамер экспериментальногоживотного, например передней камерыглаза, расположенной между роговицейи радужкой. Такой метод был использовандля изучения ранних стадий развитиязародыша, циклических измененийэндометрия и др.

4.Метод трансплантации – широкоиспользуется для изучения кроветворения.Клетки крови и костного мозга от здоровыхживотных пересаживаются животным,подвергнувшимся смертельному облучению.

Экспериментальные животные выживаютвследствие приживления донорскихклеток, образующих в селезенке колониикроветворных клеток (методколониеобразования).

Этим методомустановлены источники развития длявсех клеток крови.

Таккак ткани в организме имеют приблизительноодинаковый коэффициент лучепреломления,то иногда с целью их дифференцировкиприбегают к использованию прижизненныхкрасителей.

К прижизненнымкрасителям относятся: метиленовыйсиний, трипановый синий, конго-красный.

Прижизненныекрасители должны отвечать следующимтребованиям:

1. Быть безвреднымидля организма.

2. Быстро выводитьсяиз организма.

Окрашивание живыхобъектов имеет две разновидности:

1.Витальное (прижизненное окрашивание)красительвводят в организм животного, где онизбирательно связывается с определеннымиклетками, органеллами, межклеточнымвеществом… Например, трипановыйсиний или литиевыйкарминвыявляют фагоциты; ализарин– новообразованный матрикс кости.

2.Суправитальное окрашивание– окрашивание живых клеток, выделенныхиз организма. Таким способом красителембриллиантовымкрезиловым синим выявляютсямолодые эритроциты (ретикулоциты),янусом зеленым– митохондрии,нейтральнымкрасным – лизосомы.

Источник: https://StudFiles.net/preview/5163455/page:4/

Приготовление гистологических срезов

Ультратом - основы гистологии

Изучение патологических процессов на клеточном и тканевом уровне производится при помощи микроскопических исследований. Гистологический метод исследования необходим для изучения строения и функции клеток в состоянии нормы, патологии и экспериментальном периоде. Для гистологического исследования берутся элементы тканей и органов. Толщина исследуемого образца не может превышать 1 см3.

Образцы тканей могут браться у человека сразу после смерти (чем быстрее, тем лучше) – аутопсия. Также материал может браться во время операции или непосредственно в диагностических целях при помощи специальных инструментов – биопсия.

Приготовление образцов

Приготовление образцов происходит в несколько этапов:

  • Фиксация материала.
  • Приготовление среза.
  • Процесс окрашивания среза.

Суть фиксации материала заключается в остановке естественных процессов в тканях и клетках. Это необходимо для того, чтобы во время купировать процесс гниения и ферментативные изменения в структуре тканей.

В фиксируемых тканях за счет физико-химических процессов происходит свертывание (коагуляция) белков и липоидной составляющей. Это состояние позволяет тканям долго храниться в неизменном виде, без реакции на различные воздействия. Проще говоря, фиксация тканей проводится с целью сохранения прижизненной структуры биологического материала.

Для фиксации тканей применяются специальные жидкости (фиксаторы). Наиболее популярными фиксаторами можно назвать следующие варианты жидкостей:

  • Формальдегид.
  • Спирт (96, 100%).
  • Осмиевая кислота.

Выше перечислены простые фиксаторы. Также для фиксации тканей применяются более сложные варианты фиксаторов (растворы):

  • Спирт-формол.
  • Жидкость Ценкера.
  • Двухромовоокислый калий.

В списках указаны лишь некоторые виды применяемых фиксаторов. Продолжительность необходимого для фиксации образцов тканей периода может варьироваться от нескольких часов до суток.

Длительность зависит от особенностей исследуемых образцов и типа выбранного фиксатора. После того как этап фиксации пройден необходимо произвести промывку материала (в течение нескольких часов) в проточной воде.

Это делается для того чтобы освободить образцы от излишков фиксирующей жидкости и осадочной взвеси.

Мутные непрозрачные образцы не подходят для исследования. Такие кусочки материала не позволят получить необходимую информацию.

Перед тем как приступить к одному из главных этапов – осуществлению среза, образцы промываются чистой водой в течение нескольких часов. Далее, материал подвергается процессу обезвоживания.

Обезвоживание осуществляется при помощи проведения тканевого образца через спирты возрастающей крепости. Этот этап длительный. В каждом спирте кусочки материала находятся от 2-3 часов до суток.

После обезвоживания проводится заливка образцов. Этот этап необходим для уплотнения тканей и получения качественных блоков для исследования. Уплотнение проводится путем замораживания (срочная биопсия) или путем заливки парафином или целлоидином.

Заливка парафином – достаточно длительная процедура (от 24 часов и дольше). Такой вариант уплотнения образцов используется для осуществления исследования в обычном режиме. Для лучшей визуализации отдельных структур тканей срезы окрашивают.

Для окрашивания применяют специальные гистологические красители (кислые, основные, специальные).

Подготовленные к изучению образцы исследуют при помощи специального микроскопа.

Прежде чем приступить к изучению гистологического препарата необходимо убедиться, что последний полностью соответствует ряду обязательных требований:

  • В материале должны быть сохранены прижизненные структуры.
  • Срез должен быть тонким и прозрачным.
  • Структуры, которые требуется подвергнуть изучению должны быть четко визуализированы за счет окрашивания.
  • Препараты должны иметь длительный срок хранения.

При качественном приготовлении препарата достичь соответствия всем перечисленным требованиям достаточно просто. Однако нельзя исключить возможность возникновения небольших погрешностей. Если вовремя распознать некоторые виды неточностей, купировать брак, создать качественный материал вполне возможно.

Самыми распространенными погрешностями при приготовлении срезов можно назвать следующие варианты:

  • Крошение среза.
  • Выпадение материала из парафиновой массы.
  • Невозможность нарезки материала.
  • Разрыв материала.

Те или иные погрешности могут возникать по разным причинам. Иногда в основе нарушения качества образца лежат ошибки во время изготовления. Для устранения каждой погрешности предусмотрены определенные алгоритмы действий.

Методы гистологического исследования

Для осуществления микроскопического исследования необходимы тонкие кусочки материала. Ширина таких кусочков измеряется в микрометрах. Для удобства получения таких срезов используются специальные приборы – микротомы. Конструкция этого прибора предусматривает возможность получения срезов толщиной 5-10 микрометров.

Основным методом исследования в гистологии является микроскопия. При помощи микротома можно изготавливать тончайшие срезы, подходящие для проведения микроскопических исследований. Получение среза происходит за счет движения ножа в одном направлении. Толщина среза задается на этапе срабатывания механизма подъема.

Для изготовления срезов из материала, залитого парафином или целлоидином, используют радиальный, ротационный или санный микротом.

Для получения среза с растительных или животных тканей могут применяться специальные замораживающие микротомы. Для микроскопического исследования используется несколько методов приготовления срезов. Для каждого из методов выбираются определенные виды микротомов и применяются определенные четкие алгоритмы действий.

Гистологические срезы бывают:

  • Ступенчатые.
  • Серийные.
  • Горизонтальные.

Могут производиться срезы фиксированного и нефиксированного материала. Все зависит от характера исследуемых тканей и основных целей проведения означенного исследования. Также в гистологии существуют другие методы приготовления срезов.

Микротомы и их применение

Как уже было сказано выше, срезы в гистологии создаются при помощи специального устройства – микротома. В самом названии заложена расшифровка предназначения прибора – micros (маленький), tome (рассечение). Одним из самых используемых можно назвать санный микротом.

Название прибора произошло от принципа работы механизма, который базируется на подаче ножа с зажимом при помощи специальных салазок. Санный микротом предназначен для осуществления парафиновых срезов.

Как правило, такой прибор работает с одноразовыми лезвиями или кассетами. Такой высокоточный микротом состоит из станины, механизма микроподачи, подъемного механизма, зажимов для блоков, ножедержателя.

Такой аппарат позволяет изготавливать срезы толщиной от 0,5 до 60 микрометров. Санный микротом отличается высокоточной регулировкой толщины среза. Функция подачи материала может быть механической или ручной. Данный прибор предназначен для осуществления рутинных исследований в области медицины, ботаники и биологии.

Ротационный микротом – прибор с неподвижным ножом и подвижным столиком. В приборе предусмотрена моторизованная подача образца. Этот микротом предназначен для использования в гистологической лаборатории для проведения исследований, направленных на решение гистологических и гистопатологических задач.

Для получения срезов с нефиксированных тканей или в тех случаях, когда необходимо срочное проведение исследования используются замораживающие микротомы. Такие приборы снабжены замораживающим столиком, на котором и закрепляется исследуемый образец.

Главным правилом успешного получения гистологического среза при помощи микротома является правильный выбор угла наклона ножа и угла сечения. Наилучшим углом наклона является тот, при котором плоскость лезвия находится параллельно верхней части блока.

Если выбрать угол наклона больший, чем требуется, образуется риск, что срез будет крошиться. При меньшем угле наклона лезвие будет скользить по поверхности материала.

Получение требуемого результата при таком положении ножа невозможно. Величина угла сечения зависит от характера исследуемого материала. Чем образец мягче, тем меньше будет угол резания.

При обработке мягких блоков неплохим вариантом считается косое расположение ножа.

Резание на микротоме

Для приготовления срезов с парафинированных объектов или образцов, обработанных целлоидином, опять же чаще всего используют ротационный микротом.

Сначала блок подвергают обрезке. Это необходимо для устранения свободного парафина или другого уплотнителя. Если эту процедуру не произвести, срез может получиться неравномерным, морщинистым и, как следствие, малоинформативным. Также сморщивания можно избежать при помощи охлаждения исследуемого материала.

Далее, парафиновый блок прочно закрепляется в зажиме. Предварительно необходимо выверить правильный угол расположения ножа и выбрать необходимый угол резания. После этого нужно используя регулировку механизма подачи, установить блок так, чтобы его поверхность находилась от лезвия ножа на расстоянии 0,5-1 мм.

После осуществления подгонки проводится установка микрометрической шкалы для получения первых толстых срезов. После этого производится моделирование блока (срезка излишков парафина, предание прямоугольной формы). Заключительным этапом является выставление микрометрической шкалы на задуманную толщину и осуществление окончательной резки материала.

Источник: http://www.rumex.ru/information/prigotovlenie_gistologicheskih_srezov-332

Поделиться:
Нет комментариев

    Добавить комментарий

    Ваш e-mail не будет опубликован. Все поля обязательны для заполнения.